Wie erwartet puma basket heart black zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

U87MG-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA und PUMA-spezifischer siRNA 24 Stunden lang transfiziert und 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin, einem wirksamen Apoptose-Induktor, ausgesetzt. Die Zellen wurden dann dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. puma basket heart damen Rote Fluoreszenz: mit Propidiumiodid gefärbte Kerne. Grüne Fluoreszenz: fragmentierte DNA. Gelbe fusionierte Signale: Kernfragmentierte DNA. (B) Western Blot zeigt einen spezifischen und effizienten PUMA-Expressions-Knockdown nach der Transfektion von PUMA-spezifischer siRNA an, jedoch keine Kontrolle von nicht zielgerichteter siRNA. (C) Eine erhöhte EGFRvIII-Expression verleiht puma basket heart kinder GBM-Zellen eine Resistenz gegen Apoptose.

Nach der Behandlung mit Anisomycin gab es nur 3,1% Apoptose in U87MG-EGFRvIII-Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten die isogenen U87MG-Vektorzellen mit niedrigem EGFR-Gehalt eine massive Apoptose (49,8%), ähnlich wie bei der PUMA-Herunterregulierung (45,5%). Die Ergebnisse in 3 zeigen zusammengenommen, dass die GBM-Apoptose durch PUMA positiv reguliert und durch EGFR / EGFRvIII negativ beeinflusst wird, was darauf hindeutet, dass die PUMA- und EGFR / EGFRvIII-Pfade funktionell aber umgekehrt mit der Apoptose in GBM-Zellen verbunden sind. 4 zeigen, dass in GBM-Zellen EGFR / EGFRvIII und PUMA puma basket heart patent unter nicht belasteten Bedingungen einen Komplex bilden und dass der Komplex auch nach der Behandlung mit dem Apoptose-Induktor Staurosporin (ST) erhalten bleibt.

U87MG-EGFR- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektanten und T98G-GBM-Zellen mit endogenem EGFR wurden mit 1% DMSO und 1 & mgr; M Apoptose-induzierendem Staurosporin (ST) behandelt, geerntet und einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechts) unterzogen panel), wie bereits beschrieben. Es ist bekannt, dass sich PUMA auf den Mitochondrienmembranen befindet, um bei entsprechendem Stress eine Apoptose auszulösen [40; 41]. Begründet durch unsere Daten, die zeigen, dass EGFR und EGFRvIII PUMA gemeinsam exprimieren und interagieren und dass diese beiden Wege umgekehrt mit Apoptose verbunden sind, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII die subzelluläre PUMA-Lokalisierung regulieren könnte.

PUMA ist im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen unabhängig von apoptotischem Stress sequestriert. Das Ausmaß der mitochondrialen PUMA-Translokalisierung, mtPUMA-Index, wird wie unter Materialien und Methoden beschrieben berechnet. (A) PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen lokalisiert. Mit Vehikelkontrolle, Staurosporin (ST, 1 uM) puma basket heart sale oder Anisomycin (AN, 100 ng / ml) behandelte U87MG-EGFRvIII-Zellen wurden geerntet und in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert. Proteinextrakte aus beiden Fraktionen wurden einem Western Blot unterzogen, um PUMA, ±-Tubulin (cytoplasmatischer Marker) und Cox IV (mitochondriales Protein) nachzuweisen.

EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (5c-rechts). Zusätzlich zu GBM-Zellen fanden wir, dass PUMA im Zytoplasma von menschlichen MDA-MB-468-Brustkrebszellen lokalisiert ist (5d), von denen bekannt ist, dass sie signifikante Mengen von endogenem EGFR exprimieren [34]. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass PUMA im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden [img]http://www.awakesummerbreak.de/images/shoes/puma-345soa.jpg[/img] GBM- und Brustkrebszellen konstitutiv und unter apoptotischem Stress sequestriert wird.